Odwrotna transkryptaza MuLV ,( RNase H minus)
| Numer kat. | Wielkość opakowania | Cena netto,PLN |
| 105100 | 10000 u | 306,00 |
| 105250 | 50000 u | 952,00 |
Arkusz danych: Reverase (M-MuL V)
Comparison/Test of Reverase (M-MuL V)
Opis:
ReveraseTMjest Odwrotną Transkryptazą M-MuLV oczyszczoną ze szczepu E.coli niosącego plazmid kierujący syntezą odwrotnej transkryptazy zmodyfikowanej formy wirusa M-MuLV(Moloney Murine Leukemia).Odwrotna tarnskryptaza M-MuLV posiada aktywność RNA lub DNA polimerazy zależnej . Enzym może syntetyzować komplementarne nici DNA na matrycy RNA (synteza cDNA) lub pojedynczych nici DNA. Enzym był gnetycznie zmodyfikowany w celu usunięcia powiązanej aktywności RNazy H.Usunięcie tej aktywności spowodowało wzrost ilości produktów cDNA o pełnej długości. Masa cząsteczkowa Reverazy wynosi 69 KDa.
Stężenie:
200000 - 400 000 units/ml
Storage buffer:
50 mM TrisHCl, pH8.3, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.1 mM DTT, 0,1%Triton X-100, 50% glicerol.
Zalecany bufor reakcyjny dla RT-PCR (1x) :
50 mM TrisHCl (pH 8.3 at 25oC), 2-8 mM MgCl2, 10 mM DTT, 100 mM KCl (Jeśli potrzeba: 2-4 mM MnCl2)
Dostarczany bufor kompletny 5xRT : 250 mM TrisHCl, pH 8.3; 500 mM KCl, 15 mM MgCl2, 50 mM DTT
Dostarczany bufor niekompletny 5xRT : 250 mM TrisHCl, pH 8.3; 500 mM KCl and with extra tubes MgCl2 (100 mM) and DTT (100 mM)
Definicja jednostki:
Jedna jednostka aktywności to ilość enzymu niezbędna do włączenia 1 nmola dTTP do nierozpuszczalnego kwasu w ciagu 10 minut w 37oC używajac poli A-oligo(dT) jako matrycy i startera.
Warunki przechowywania: -20oC
Synteza cDNA z wykorzystaniem Reverazy
Protokół
1. Wymieszać w probówce: 1-5 µg RNA (lub 50-500 ng polyA RNA) 10 pmoli starterów (lub 250-500 ng oligo-dT na każdy µg RNA) dodać nie więcej niż 8 µl wody.
2.Inkubować mieszaninę 10 min w 70°C,a następnie 10-15 min w temperaturze pokojowej(dla specyficznych starterów) lub umieścić w lodzie w przypadku oligo dT lub losowych starterów
3. Dodać do mieszaniny:
- 4 µl of 5xRT buforu kompletnego (250 mM TrisHCl, pH 8.3; 500 mM KCl, 15 mM MgCl2, 50
mM DTT)
- 1 µl dNTP mix (10 mM każdego dNTP; Cat.-No: 110001 i 110002)
- RNazy - 20-40 jednostek (jeśli potrzeba)
- Reveraza - 200 jednostek
- H2O -nie więcej niż 20 µl
4. Inkubować mieszaninę w 37-55°C przez 30-120 min. Czas reakcji zależy od długości cDNA. W przypadku cDNA o długości 500bp , wystarcza 30 minut, dla cDNA dłuższego niż 1,5 kb czas należy wydłużyć do 120 minut. Temperatura reakcji zmienia się w zależności od struktury RNA. Należy podwyższyć temperaturę (do 55°C)w przypadku wysoce zorganizowanego RNA. Optymalna temperatura oraz czas reakcji powinny być zoptymalizowane oddzielnie dla każdego RNA. Zalecamy użycie buforu o pH 8,8 w przypadku zastosowania podwyższonej temperatury
5. Podgrzewać mieszaninę przez 10 min w 65-70°C to w celu inaktywacji Reverazy.
6. Mieszanina taka może być wykorzystana między innymi do reakcji PCR. Reveraza oraz bufor RTx5 nie mają aktywności RNazy , jednakże zalecamy dodanie RNazy do mieszaniny w celu inhibicji ewentualnego zanieczyszczenia próbki Rnazą.
Do reakcji PCR potrzeba 5-10 µl produktów powstałych podczas RT-PCR . Standardowy protokół do reakcji PCR mozna odnaleźć na naszej stronie w sekcji Teoria PCR.
proszę dodawać odpowiednie ilości MgCl2, MnCl2 (jesli istnieje taka potrzeba), DTT, dNTPs do reakcji.
Warunki przechowywania:
-20oC
