Teoria i protokoły PCR
PDF: 10 things that can kill Your PCR (by Peter Frame)
Wstęp
Pomysł tworzenia nieograniczonej liczby pojedynczych kopii DNA, który w przyszłości nazwany został "Łańcuchhowa reakcja polimeryzacji PCR" , został stworzony przez Karry'ego B.Mullis'a w roku 1983, który 10 lat później otrzymał nagrodę Nobla za to doskonałe odkrycie.
Poraz pierwszy PCR zostało opublikowane w 1985 roku(Saiki et al., 1985). Do elongacji wykorzystywano polimerazę Klenowa. Ponieważ polimeraza ta była niestabilna podczas ogrzewania, do każdego cyklu należało dodać nową porcję enzymu. Maksymalna długość produktu wynosiła zaledwie 400 bp. W 1988 opublikowano pierwszy raport, który mówił o wykorzystaniu termostabilnej polimerazy DNA wyizolowanej z Thermophilus aquaticus (Taq-polymerase) (Saiki et al., 1988). Dzisiaj technika PCR jest potężnym i standardowym narzędziem wykorzystywanym w biologii molekularnej.
Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB, Erlich HA. (1988) Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 239:487-491.
Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N. (1985) Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analyses for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 230:1350-1354.
Podstawy
Podwójnie zwinięte DNA jest denaturowane do pojedynczych nici DNA. Krótki komplemantarny fragment DNA (starter) wiąże się do sekwencji pojedynczej nici DNA (matryca). Starter rozpoznaje matrycę i wiąże się (przyłącza) do rozpoznawanej sekwencji. Koniec 3' startera jest wykorzystany przez polimerazę DNA do syntezy nowych nici DNA(elongacja / wydłużanie).
Trzystopniowy cykl(Denaturacja, Przyłączanie oraz Elongacja) zależy od temperatury. Tak więc nowo powstała podwójna nić DNA jest na nowo denaturowana w temperaturze 94-97ºC. Poprzez obniżenie tej temperatury startery mogą przyłączyć się w 35-72ºC (odpowiednia temperatura zależy od starterów), a nowy produkt jest syntetyzowany w 72ºC, ktra jest temperaturą optymalną dla polimerazy- Taq.
Powielanie identycznych kopii DNA z matryc będzie się powtarzało w każdym cyklu. jeden cykl powoduje podwojenie ilości DNA. Po 25 cyklach otrzymamy 3,2 x 107 molekuł DNA . W ten sposób sekwencje DNA pomiędzy dwoma starterami są amplifikowane w sposób wykładniczy, co daje wysokie stężenie podwójnie skręconych nici DNA o takiej samej długości.
