Klein Taq
| Nr katalogowy | Opakowanie | Cena netto, EUR | SKLEP |
| 118002 | 200 u | 75,00 | dodaj do wózka |
| 118010 | 1000 u | 299,00 | dodaj do wózka |
Arkusz danych: Klein Taq DNA Polimeraza
Charakterystyka:
Klein Taq jest pochodną Taq DNA polimerazy. Jest to enzym pierwotnie wyizolowany z <em>Thermus aquaticus</em> przycięty na N-końcu 5'-egzo-minus. Polimeraza ta pochodzi również z genetycznej wstawki u <em>E.coli,</em> translację inicjuje Met236, pomijana jest domena 5'-3' egzonukleazy DNA polimerazy w genie kodującym.
Enzym ten przejawia wysoką aktywność i nawet wyższą stabilność w wysokich temperaturach w porównaniu do Taq DNA polimerazy. Optymalny zakres stężenia jonów Mg2+ dla Klein Taq jest szerszy niż dla większości termostabilnych polimeraz. Cecha ta pozwala na łatwiejszą optymalizację warunków reakcji. Powtórzona ekspozycja w temperaturze 98°C nie redukuje aktywności enzymu. Klein Taq Polimeraza przejawia wyraźną aktywność nawet po ekspozycji w 99°C.
Częstość mutacji podczas polimeryzacji jest dwukrotnie niższa dla Klein Taq w porównaniu z Taq DNA polimerazami. Klein Taq ma bardzo niską zdolność do wydłużania niedopasowanych oligonukleotydów na końcu 3', dzięki czemu enzym ten moża byc stosowany do analizy mutacji ze swoistymi mutacjami w oligonukleotydach.
Stężenie:
5-10000 units/ml
Definicja jednostki: jedna jednostka aktywności to ilość enzymu wystarczająca do przyłączania 10 nmoli dNTP do nierozpuszczalnej frakcji DNA w czasie 30 minut w temperaturze 72°C.
Bufor do przechowywania:
10 mM K-fosforan pH 7.0, 100 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.01% Tween 20, 50% glicerol
Warunki przechowywania:
-20oC
Bufor reakcyjny 10x 'incomplete':
160 mM (NH4)2SO4; 670 mM Tris-HCl pH (ph 8,8) ; 0.1% Tween-20
Bufor reakcyjny 10x 'complete':
160 mM (NH4)2SO4; 670 mM Tris-HCl pH (ph 8,8) ; 0.1% Tween-20, 25 mM MgCl2
Bufor reakcyjny 10x 'complete' II KCl:
500 mM KCl; 100 mM Tris-HCl pH (ph 8,8) ; 0.1% Tween-20, 15 mM MgCl2
Plus probówka MgCl2 (100mM)
Kontrola jakości:
Aktywność, czystość SDS-PAGE, brak endonuklaz/nikaz i egzonukleaz
Klein Taq protokół do amplifikacji ~ 2000 bp
dla objętości 50 µl:
| Matryca DNA | 10 - 15 ng plazmidowego DNA | |
| Primer | 0.1 - 1 µM stężenia końcowego | |
| dNTPy | 0.2 mM każdego (końcowe stężenie) | |
| KleinTaq | 2-12 jednostki w 50 µl | |
| 10x bufor reakcyjny 'complete' (z MgCl2) firmy Bioron | 5 µl | końcowe stężenie MgCl2 2.5 mM |
| dopełnić H2O do 50 µl |
Cykle PCR:
Liczba cykli w reakcji PCR jest zależna od ilości matrycowego DNA. W większości przypadków liczba 25 cykli jest wystarczająca. Dla niskokopijnych genów lub rzadkiego DNA zalecanych jest 30-35 cykli. Parametry amplifikacji w różnym stopniu mogą zależeć od używanych starterów, wielkości amplikonu i termocyklera. Konieczna może okazać się optymalizacja systemu. Dla amplikonu wielkości 5 - 10 kb wydłuża się czas etapu elongacji do 6-10 min.
Przykład: Termocykler 480 (Perkin-Elmer-Cetus); wielkość amplikonu 500 - 2000 bp, matryca 10 ng plazmidowego DNA.
Reakcja prowadzona jest w 25 cyklach:
94°C 30 - 45 s
58 - 61°C 30 s
72°C 100 s
