DFS-Taq Mastermix (2X)

Informacja: Mastermixy są przeliczane na objętość reakcyjną wynoszącą 50 µl. Korzyść: pracując na objętości 25 µl można przeprowadzić 200 testów.

Arkusz danych: DFS-Gen-Taq Master Mix (A)

Charakterystyka:
2x PCR Master Mix to zoptymalizowana, gotowa do użycia mieszanina Taq DNA polimerazy, buforu do PCR, MgCl₂ i dNTP. 2x PCR Master Mix zawiera wszystkie komponenty reakcji PCR, za wyjątkiem matrycy DNA i starterów. Mix zawiera DFS-Taq DNA Polimerazę - polimerazę bez śladu DNA <em>E.coli</em>, ale ze zwiększoną zdolnością do detekcji niskokopijnych genów (Bioron, kat# 101005, 101025, 101100, 101500). Ze względu na obecność DFS-Taq DNA polimerazy, mix może być stosowany nie tylko do wszystkich standardowych reakcji PCR, ale również do matryc zawierających sekwencje DNA <em>E.coli</em>.

2x PCR Master Mix - skład:

• Taq DNA Polimeraza (rekombinant) w buforze reakcyjnym: 0.1 units/ µl   
• 32 mM (NH₄)₂SO₄    
• 130 mM Tris-HCl, pH 8.8, 25^oC  
• 0,02% Tween-20  
• 5,5 mM MgCl₂    
• dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP): 0.4 mM każdego

Działanie i testy na czystość:
Mix był testowany na obecność endo- i egzodeoksyrybonukleaz. Jego działanie sprawdzono na pojedynczych kopiach genów ludzkich oraz mysich.

Próba na endodeoksyrybonukleazy:
Nie wykryto konwersji kolistej formy DNA do formy liniowej po inkubacji 25 µl 2x PCR Master Mix z 1 µg DNA pUC19 w mieszaninie o objętości 50 µl przez 4 godziny zarówno w temperaturze 37°C jak i 70^oC.

Warunki przechowywania:
MasterMix powinien być przechowywany w temperaturze -20^oC. Powtarzane (do 10 razy) zamrażanie i rozmrażanie nie powoduje redukcji wydajności w reakcji PCR, przechowywanie w temperaturze +4^oC przez 1 tydzień również nie skutkuje obniżeniem wydajności w działaniu.       

Protokół: Zalecane jest nastawianie wszystkich reakcji na lodzie w celu uniknięcia powstawania niespecyficznych produktów lub dimerów primerów.

Do cienkościennych probówek dodać:

50 µl objętość reakcyjna

50 µl objętość reakcyjna

składnik	objętość	końcowe stężenie	objętość	końcowe stężenie
2x PCR Master mix	25 µl	1x	12.5 µl	1x
MgCl2	zmiennie	zmiennie	zmiennie	zmiennie
forward primer	zmiennie	0.1 - 1 µl	zmiennie	0.1 - 1 µl
reverase primer	zmiennie	0.1 - 1 µl	zmiennie	0.1 - 1 µl
matryca DNA	zmiennie	10 pg - 1µg	zmiennie	10 pg-1µg
sterylna woda dejonizowana	do 50 µl	-	do 25 µl	-

•    Delikatnie zworteksować próbkę i lekko zwirować, aby umieścić wszystkie krople na dnie

•    Nałożyć olej mineralny lub dodać odpowiednią ilość wosku, jeżeli termocykler nie posiada pokrywy ogrzewanej

•    Umieścić próbki w termocyklerze i rozpocząć standardowy program PCR.

Jeżeli MgCl₂ nie zostało dodane do mieszaniny reakcyjnej, końcowe stężęnie MgCl₂ w mieszaninie będzie wynosiło 2,75 mM. Dodanie 1 µl 100 mM MgCl₂ do mieszaniny reakcyjnej da stężenie 4,75 mM MgCl₂ w objetości końcowej 50 µl.