Odwrotna Transkryptaza AMV
| Numer kat. | Wielkość opakowania | Cena netto,PLN |
| 105400 | 200 u | 157,50 |
| 105410 | 1000 u | 595,00 |
Arkusz danych : AMV-Reverse Transcriptase
Opis
Odwrotna transkryptaza AMV (AMV RT) katalizuje polimeryzację DNA na matrycach DNA, RNA lub hybryd RNA:DNA(1). Wymaga starterów DNA (startery DNA są bardziej wydajne niż startey RNA) ale również jonów Mg 2+ lub Mn 2+. Enzym posiada istotną aktywność RNazy H . Proszę o zapoznanie się z instrukcją obsługi przed użyciem enzymu.
Źródło: Oczyszczony z ptasiego wirusa myeloblastosis .
Zastosowanie AMV-RT obejmuje:
• Syntezę nici cDNA z RNA (2).
• Sekwencjonowanie transkryptów RNA (3).
Stężenie: 5000 – 15.000 units/ml
Bufor reakcyjny (AMV-RT): 250 mM TrisHCl, (pH 8,3 at 25°C), 250mM KCl, 50 mM MgCl2, 2,5 mM spermidine and 50 mM DTT.
Bufor : Odwrotna transkryptaza AMV (AMV-RT) jest dostarczana w 200 mM fosforanie potasu (pH7.2 w 4°C), 0,2 % Triton X-100, 2 mM DTT i 50% glicerol.
Definicja jednostki: Jedna jednostka jest definiowana jako ilość enzymu niezbędna do katalizowania reakcji przejścia 1 mmol deoksynukletydu w wytrącony kwasu w ciągu 10 minut w 37°C. Warunki reakcji: 50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 40 mM KCl, 8.75 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,1 mg/ml acetylowany BSA, 1 mM metkowanego radioaktywnie dTTP oraz 0.25 mM poli(A): oligo(dT). należy sparwdzić stężenie jednostek na etykiecie dołączonej do produktu.
Warunki przechowywania: -20°C
Protokół syntezy nici cDNA:
1. Zmieszać w probówce:
- 2µg całosciowego RNA (lub 50-500ng poliA RNA)
- 500 ng starterów na każdy µg RNA dodać do 8µl wody (<11 µl)
2. Inkubować mieszaninę: 5 min w 70°C, następnie ochłodzić przez 5 minut w lodzie
3. Dodać do mieszaniny:
- 5 µl 5xRT buforu kompletnego(250mM TrisHCl, pH8,3; 500mM KCl, 15mM MgCl2, 50mM DTT)
- 2,5 µl dNTP mix (10mM of each dNTP; Cat.-No: 110001 and 110002)
- 40 jednostek RNAzy(dowolnie)
- 2,5 µl pirofosforanu sodu, 40mM (wcześniej ogrzanego do 42°C)
- 30 jednostek AMV RT - H2O (wolna od nukleaz) – do 25 µl
4. Zamieszać delikatnie: przenieść 5 µl mieszaniny reakcyjnej do innej probówki zawierajacej 2-5 µCi [α-32P]dCTP. Nie dodawać metek do pozostałych 20µl mieszaniny reakcyjnej. Uwaga: Zalecamy użycie [α-32P]dCTP nie starszego niż 1 tydzień.
5.Inkubować mieszaninę : przez 60 min w42°C dla starterów oligo(dT) lub w 37°C dla losowych starterów.
6. Inaktywacja enzymu:Umieścić reagenty , z metkami oraz bez, na lodzie i dodać 95µl 50 mM EDTA do reagentów z metaką(znacznik) . Objetość reakcyjna powinna teraz wynosić 100 µl. Znacznik reakcji może byc użyty do oznaczania prób oraz podczas elektroforezy żelowej.
7.Przeprowadzić drugi etap syntezy: w tym celu nalezy użyć mieszaniny reakcyjnej bez metek,sprawdzić odnośnik (4). Nie jest wymagane wytrącanie etanolem czy ekstarkcja fenolem.
Sekwencjonowanie transkryptów RNA Protokół do sekwencjonwania transkryptów RNA można odnaleźć w odnośniku (3).
Nota do użytkownika:
1.Tworzenie 5xbuforu reakcyjnego dla odwrotnej transkryptazy AMV nie jest zgodne z buforem dla Odwrotnej transkryptazy MLV
