Exonuklease III
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Deutsches Datenblatt: Exonuklease III
Beschreibung:
Exonuklease III ist eine 3’-5’ Exonuklease, die spezifisch für doppelsträngige DNA ist. Das Enzym katalysiert mehrere Reaktionen. Erstens, den schrittweisen 3’ - 5’ Abbau von 5’-Mononukleotiden von Doppelstrang DNA mit einem 3’-OH Ende. Als Substrat dient ds DNA mit einem Einzelstrangbruch, mit blunt ends oder 3’ recessed ends. Exonuklease III ist nicht aktiv an 3’-Überhängen mit 4 oder mehr Basen. Zweitens zeigt die Exonuklease III eine 3’-Phosphatase Aktivität und baut DNA vom 3’-Phosphatende her ab. Weiterhin zeigt das Enzym eine Ribonuklease H Aktivität und eine Apurinic Endonuklease Aktivität. Die Exonuklease III Aktivität hängt teilweise von der helikalen Struktur ab und zeigt eine gewisse Sequenzabhängigkeit (C>A=T>G). Da Temperatur, Salzkonzentration und das Verhältnis von Enzym zu DNA einen großen Einfluss auf die Enzymaktivität haben, erfordert dies eine genaue Anpassung der Reaktionsbedingungen an die jeweilige Anwendung. Exonuklease III wird in Verbindung mit S1 Nuklease für die unidirektionale Entfernung von Basen vom Strangende von DNA-Fragmenten eingesetzt.
Herkunft:
Wird rekombinant in E. coli exprimiert.
10X Reaktionspuffer:
500 mM Tris-HCl (pH 7,6 bei 30°C), 100 mM MgCl2.
Anwendungsbereiche:
· unidirektionale nested deletions
· Site-directed mutagenesis
· Präparation Strang-spezifischer Proben
· Präparation linearer DNA als Template für DNA Polymerasen (z.B. Dideoxy Sequenzierung)
Unit Definition:
Eine Unit ist definiert als die Menge an Enzym, die benötigt wird, um 1 nmol säurelösliche Nukleotide innerhalb von 30 Minuten bei 37°C zu produzieren.
Konzentration:
40000-100000 units/ml.
Lagerbedingungen:
-20°C.
Hitzeinaktivierung:
70°C für 20 Minuten.
