Reverase (M-MuL V) RNase H minus
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Datasheet: Reverase (M-MuL V)
Comparison/Test of Reverase (M-MuL V)
Beschreibung:
ReveraseTM M-MuLV Reverse Transcriptase ist ein Genprodukt des Moloney Murine Leukemia Virus (M-MuLV) mit RNA abhängiger DNA-Polymeraseaktivität (Reverse Transkriptaseaktivität). Die normalerweise vorhandene RNase H-Aktivität wurde durch eine Deletion depletiert. Das Molekulargewicht der Reverase beträgt 69 kDa.
Anwendungsbereich:
- Erststrang-Synthese für RT-PCR-Reaktionen oder cDNA-Banken
- Zweistrang-Herstellung für cDNA-Banken oder Klonierungen
- Ausfüllen und Labeling von DNA-3' Enden mit 5'-Überhängen
Konzentration:
200 000-400 000 units/ml
Lagerpuffer:
50 mM TrisHCl, pH8.3, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.1 mM DTT, 0,1%Triton X-100, 50% Glyzerin.
Reaktionspuffer für RT-PCR (1x) :
50 mM TrisHCl (pH 8.3 at 25oC), 2-8 mM MgCl2, 10 mM DTT, 100 mM KCl (Optional: 2-4 mM MnCl2)
5xRT buffer "complete": 250 mM TrisHCl, pH 8.3; 500 mM KCl, 15 mM MgCl2, 50 mM DTT
5xRT buffer "incomplete": 250 mM TrisHCl, pH 8.3; 500 mM KCl und extra Tubes MgCl2 (100 mM) und DTT (100mM).
Einheitendefinition: Eine Unit ist die Menge an Enzym, die 1 nmol dTTP mit poly(A)-oligo(dT) als Template-Primer bei 37°C in 10 min in säureunlösliches Material umwandelt.
Lagerbedingung: -20oC
cDNA Synthese mit Reverase
Protokoll
1. Mischen Sie im einem Reaktionsgefäß: 1-5 µg Gesamt-RNA (oder 50-500 ng polyA RNA) 10 pmole
Strang-spezifischen Primer (oder 250-500 ng oligo-dT pro µg RNA). Füllen Sie auf ein
Gesamtvolumen von 8 µl mit Wasser auf.
2. Inkubieren Sie den Ansatz 10 min bei 70°C, dann 10-15 min bei Raumtemperatur (wenn
Sie spezifische Primer verwenden) oder stellen Sie den Ansatz in Eis bei Verwendung von Oligo dT
oder Random primer
3. Geben Sie folgende Komponenten zu:
- 4 µl of 5xRT buffer complete (250 mM TrisHCl, pH 8.3; 500 mM KCl, 15 mM MgCl2, 50
mM DTT)
- 1 µl of dNTP mix (10 mM of each dNTP; Cat.-No: 110001 and 110002)
- RNAsin - 20-40 units (optional)
- Reverase - 200 units
- H2O - auf 20 µl Gesamtvolumen auffüllen.
4. Inkubieren Sie den Reaktionsansatz bei 37-55°C für 30-120 min. Die Reaktionszeit ist abhängig von
der gewünschten cDNA-Länge. 30 min sind für eine cDNA-Länge con 500bp ausreichend, 120 min
sind notwendig für eine cDNA-Länge von mehr als 1.5 kb. Die Reaktionstemperatur ist abhängig von
der RNA-Struktur. Für eine stark strukturierte RNA ist eine höhere Temperatur erforderlich (bis zu
55°C) Die optimale Reaktionstemperatur sowie Inkubationszeit sollte für jede RNA individuell
bestimmt werden.The optimal temperature and reaction time should be adjusted for each particular
RNA. Wir empfehlen die Verwendung eines Reaktionspuffers mit pH 8,8 bei hohen
Reaktionstemperaturen.
5. Erhitzen Sie den Reaktionsansatz für 10 min bei 65-70°C zur Inaktivierung der Reverase.
6. Der inaktivierte Mix kann nun für die PCR oder andere Applikationen eingesetzt werden.
Die Reverase und die RTx5 Puffer sind frei von RNase-Aktivität Zusätzlich empfehlen wir die Zugabe
von RNasin zum Reaktionsmix um RNase zu inhibieren die über ein mögliche Kontamination in die
Probe gelangt ist.
Für die PCR-Reaction setzen Sie 5-10 µl des RT-PCR Produkts ein. Ein Standard-Protokoll für die
PCR finden Sie auf unserer Web-Seite unter PCR Theory Section.
Bitte vergessen Sie nicht die erforderlichen Mengen an MgCl2, MnCl2 (optional), DTT, dNTPs zum Reaktionsmix zuzugeben.
Lagerbedingungen: -20oC
