Kleine Einführung in die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Enzymatische DNS - Amplifikation mittels PCR (Polymerase Chain Reaktion = Polymerase - Kettenreaktion)
Generell: Die Vervielfältigung (Amplifikation) von DNS in vitro wurde 1983 von Kary Mullis erdacht und 1985 erstmals publiziert. Er wurde für diese `Erfindung´ 1993 mit dem Nobel - Preis ausgezeichnet. Diese neue Technik wurde wegen der exponentiellen Vermehrungsrate der DNS als Polymerase - Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaktion) oder auch kurz `PCR´ genannt. Das Prinzip lässt sich wie folgt beschreiben: Es basiert auf der Denaturierung einer ds DNS - Probe, an welche sich am 5´ - und 3´ - Ende spezifische Oligonukleotide (Primer) anlagern (Annealing). Diese Primer werden von einer DNS - abhängigen DNS Polymerase in Anwesenheit freier Desoxynukleosid - Triphosphate (dNTPs) verlängert (elongiert). Die DNS Polymerase elongiert den entstehenden DNS - Doppelstrang (ds DNS) solange, bis sie von der DNS `abfällt´ oder die Reaktion unterbrochen wird. Dieser Abbruch kann z.B. durch eine Erhöhung der Inkubationstemperatur auf 95°C verbunden mit der Denaturierung der ds DNS erfolgen. Kühlt man den Ansatz in Anwesenheit freier Primer wieder auf 60° - 40°C, so binden diese in Abhängigkeit ihres mittleren Schmelzwertes (Tm - Wertes) an die komplementären Sequenzen des Templates. Die Synthese eines weiteren Doppelstranges kann jetzt wiederholt werden. Die PCR bietet in Kombination mit einer thermostabilen DNS Polymerase den Vorteil, dass alle Komponenten (Enzym, Template, Primer, dNTPs, etc.) in einem Reaktionsgefäß zusammengeführt und die DNS vollautomatisch in einem Thermocycler amplifiziert werden kann. Die Effizienz bzw. Sensitivität dieses Systems zeigt sich schon bei der Durchführung von 25 PCR - Zyklen, da aus einem Zielmolekül bereits 3,2 x 107 Kopien synthetisiert werden. Bei 30 Zyklen erhält man eine Milliarde Kopien.
Template: Die eingesetzte DNS muss rein sein (OD 260/280 1,8 - 2,0). Die Menge des Templates hängt von der zu amplifizierenden DNS - Größe ab und kann von pg (Plasmid und Phagen DNS) bis zu µg (genomische DNS) betragen. Die DNS - Lösung sollte frei von hemmenden Substanzen wie z.B. EDTA/EGTA sein
Primer: Sollten in hohem Überschuss (0,2 - 0,8 µM) im PCR - Ansatz enthalten sein. Das Basenverhältnis G/C zu A/T sollte annähernd gleich sein. Die Länge der Primer sollte zwischen 12 - 50 Basen liegen. Die Annealing - Temperatur sollte etwa 5°C unter dem Tm - Wert liegen. Formel für Primer bis 15 Basen : Tm = 4 x (G + C) + 2 x (A + T)
Intern zueinander komplementäre Sequenzen bilden so genannte Sekundärstrukturen (Hairpin) aus, diese sollten vermieden werden. Sollen zusätzliche Nukleotide (z.B. für die Insertion einer Restriktionsschnittstelle) eingefügt werden, so ist es Vorteilhafter diese am 5´- Ende des Primers zu lokalisieren. Um eine funktionierende Restriktionsschnittstelle zu bilden, sollten mindestens vier zusätzliche Nukleotide angefügt werden. Bei der Berechnung des Tm - Wertes werden diese nicht verrechnet.
MgCl2 und MgSO4 - Konzentration kann die Spezifität und Ausbeute der PCR erheblich beeinflussen. In der Regel werden Konzentrationen von 1,0 bis 10 mM final verwendet. Ob MgCl2 (1-4 mM für Taq) oder MgSO4 (1-10 mM für Pfu bzw. Psp.) hängt von der DNS Polymerase ab. Die optimale Konzentration kann von PCR zu PCR verschieden sein. Sollten Standardpuffer (komplett) erfolglos sein, muss titriert werden.
- Zu niedrige Konzentrationen führen zu einer geringen Ausbeute.
Allerdings ist bei einem Überschuss freier Mg2+ - Ionen mit der Synthese unspezifischer PCR - Produkte zu rechnen. Mg2+ - Ionen bilden einen löslichen Komplex mit freien dNTPs. Hierdurch werden der dNTP - Einbau und die Polymeraseaktivität gesteigert.
DNTPs (Desoxynukleosid ? Triphosphat) Die Konzentration jedes dNTPs (dATP, dCTP, dGTP and dTTP) sollte 200 µM im Ansatz betragen. Zu hohe Konzentrationen können die Reaktion hemmen.
Einiges zu den 5´- 3´Polymerasen: Polymerasen unterscheiden sich in einigen Parametern. Gerade wenn neue Gene sequenziert werden sollen oder ein Gen zur Expression gebracht werden soll, ist es essentiell, dass die Polymerase über eine geringe Fehlerrate verfügt. Dies geht leider auf kosten der Prozessivität. Hier zwei Beispiel der Fehlerrate und Prozessivität:
| Taq DNA Pol. | Pyrococcus spec. (Kurz Psp) | |
| Fehlerrate | 2,4 x 10-5 | 0,4 x 10-5 |
| Prozessivität | 1000 bp/min | 500 bp/min |
Psp/Pfu- Polymerasen verfügen über ein so genanntes 3´- 5´ Exonukleaseaktivität (auch ?proofreading? genannt). Diese Aktivität fehlt den hoch prozessiven Taq ? Polymerasen.
Ferner erzeugen Psp- Polymerasen (Pyrococcus spec.) glatte Enden (blunt), wohingegen Taq durch ihre Transferase Aktivität der DNS Polymerase zusätzliche A Nukleotide am 3`- Ende des PCR - Produkt anhängt. Dies ermöglicht das Klonieren in einen T/A ? Vektor, sogenanntes T/A ? Cloning.
Bitte finden Sie auf dieser Seite die wichtigsten Informationen:
PCR-Einführung PCR Parameter 5´-3´- Polymerasen Kurzprofil: Taq
Kurzprofil: Pfu Kurzprofil: Psp Standart-Ansatz Cycler-Programm
Cycler-Zyklen Titration Mg+
Kurzprofil:
Abkürzung: Taq Name: Thermus aquaticus Optimum: 72°C
- Für effiziente Amplifikation unter 10 kb. Fehlende 3´- 5´ Exonukleaseaktivität.
- Die Taq DNS Polymerase fügt dem PCR - Produkt ein Adenosin - Nukleotid an das 3´- Ende an. Daher können diese Fragmente für das sogenannte T/A - Cloning eingesetzt werden.
- Ion: MgCl2
- 1000 bp/min
- Pro 50µl 0,5 ? 2U/50µl einsetzen
Abkürzung: Pfu Name: Pyrococcus furiosus (Archaebakterium) Optimum: 75°C
- `Proofreading´ DNS Polymerase (mit Lesekorrektur)(3´- 5´ Exonukleaseaktivität)
- Pfu und Psp Polymerasen generieren an jedem amplifizierten DNS - Fragment glatte Enden. Bis 15 ? 20 kb.
- Ion: MgSO4
- 500 bp/min
- Pro 50µl 1,25 ? 2, 5U/50µl einsetzen
Abkürzung: Psp Name: Pyrococcus species Optimum: 75°C
- Je nach Pyrococcus spec. ist unbedingt auf das Enzym ? Optimum zu achten, da diese zwischen 68 ? 78 ° C variieren kann.
- Ion: MgSO4
- 500 bp/min
- Pro 50µl 1,25 ? 2, 5U/50µl einsetzen
Unit - Definition :
Die Bestimmung der Einheiten (Units) werden für alle thermostabilen DNS Polymerasen jeweils unter optimalen Reaktionsbedingungen durchgeführt. Im allgemeinen ist eine Einheit (Unit) die Enzymmenge, die bei 68° - 75°C in 30 Min. 10 nmol dNTPs in säureunlösliches Material überführt.
Procedere
Das Volumen des Probenansatzes kann je nach Fragestellung stark variieren (25 - 100 µl).
Je nach Fragestellung trifft man die Wahl für die geeignete DNS Polymerase. Des weiteren ist zu beachten, dass die Reaktionspuffer komplett (mit MgCl2 bzw. MgSO4) oder inkomplett (ohne MgCl2/MgSO4 ) sein können, bei letztgenannten Puffer muss also MgCl2 bzw. MgSO4 zugesetzt werden. Die Menge des Templates kann ebenfalls stark variieren (siehe Tabelle unter ` Einige Parameter zur PCR ´). Häufig lässt man einen Kontrollansatz ohne Template mitlaufen (negativ Kontrolle), d.h. das Volumen des Templates wurde durch H2O ersetzt. Es empfiehlt sich auch, eine geeignete Positiv-Kontrolle mitzuführen. Wichtig ist, dass die Polymerase zuletzt pipettiert wird.
Bsp. für einen 50 µl Probenansatz mit 100 ng DNS-Matrize:
Ansatz mit | Taq/Super | Pfu /Psp | Endkonzentration |
| Template | 1 µl (100ng) | 1 µl (100ng) | (Standard ? PCR)100 ng/PCR ? Reaktion bzw. variabel |
| (DNS ? Matrize) | oder eine Bakterien - Kolonie oder 5µl Bakterien-suspension aus Übernacht-Kultur | ||
| 10 x Reaktionspuffer "(in)complete"(wird für jeweilige Polymerase mitgeliefert) | 5 µl | 5 µl "complete"enthält MgSO4 | 1 x |
| MgCl2 (25 mM) | 3 µl | - | 2,5 mM/2 mM |
| dNTPs (10 mM) | 1 µl | 1 µl | 0,2 mM |
| Primer A (Sense, 10 µM) | 4 µl | 4 µl | 0,8 µM |
| Primer B(Antisense, 10 µM) | 4 µl | 4 µl | 0,8 µM |
| Destilliertes H2O (autoklaviert) | 31,5 µl | 34 µl | - |
| Polymerase | 0,5 µl | 1 µl | - |
Bei einer Vielzahl an Ansätzen empfiehlt es sich einen so genannten Master-Mix anzusetzen, d.h. alles bis auf die variable Komponente(n) wird vorgelegt. Hierbei sollte man 20% mehr ansetzen als errechnet.
PCR - Programm am Thermocycler (nicht optimiert)
1. Schritt : 5 Min. bei 94°C denaturieren.
2. Schritt : 30 Sek. bei 94°C denaturieren.
3. Schritt : Annealing (Anlagerung der Primer an die Matrize) bei 55°C für 30 - 120 Sek., Achtung Temperatur kann je nach Primern variieren.
4. Schritt : Elongation (Synthese der DNS) bei 68° - 78°C je nach verwendeter Polymerase; i.R. werden ca. 500 - 1000bp/min. amplifiziert, so dass die Zeit von der Größe des zu amplifizierenden Fragmentes abhängt.
5. Schritt : Elongation bei 68° - 78°C für 5-15 Min.
6. Schritt : Nach erreichter Zyklenanzahl wird der Ansatz bei 4°C gekühlt.
In der Regel amplifiziert man 25 - 35 Zyklen, d.h. die Schritte 2 - 4 wiederholen sich 25 - 35 mal. Für analytische Zwecke sind 25 Zyklen in der Regel ausreichend. Bei Verwendung von genomsicher DNS oder einer Proofreading ? Polymerase werden 30-35 Zyklen empfohlen.
Schnellübersicht der Thermozyklen:
Schritt | Temperatur (°C) | Zeit (Minuten) | Zyklen |
| Initiale Denaturierung | 94 - 95 | 1-5 | 1 |
| Denaturierung | 94 - 95 | 0,5 | |
| Annealing | 55; variiert sehr stark, Tm des Primers beachten | 0,5 ? 2 | 25 - 35 |
| Elongation/Extension | 72, Achtung Optimum der Polymerase beachten | 1- 15 je nach Prozessivität der verwendeten Polymerase und der Größe des Fragments | |
| Finale Elongation/Extension | 72, Achtung Optimum der Polymerase beachten | 5-15 | 1 |
| Kühlung der Probe | 4 | unendlich |
Troubleshouting:
- Titration von MgCl2 oder MgSO4
Sollte mit den mitgelieferten kompletten (mit Mg2+)10 x Reaktionspuffer wenig amplifiziert werden oder multiple Fragmente erhalten werden, ist es notwendig die Mg2+ - Ionen Konzentration auszutitrieren. Folgende Konzentrationen werden empfohlen:
Taq: 1 ? 4 mM MgCl2
Pfu bzw. Psp: 1- 10 mM MgSO4
Hierbei wird der für die Polymerase entsprechende "incomplette" 10x Reaktionspuffer benutzt und mit einer mitgelieferten 25-100 mM MgCl2 für Taq oder 25mM MgSO4 für Psp/Pfu Lösung wie folgt komplementiert:
| Finale Konzentration ( in mM ) an MgCl2 oder MgSO4 in einem 50µl Reaktionsmix | 1,0 | 1,25 | 1,5 | 1,75 | 2,0 | 2,5 | 3,0 | 4,0 |
| Einzusetzendes Volumen (in µl) an 25mM MgCl2 bzw. MgSO4 | 2 | 2,5 | 3 | 3,5 | 4 | 5 | 6 | 8 |
Man beachte, dass dementsprechend das Volumen an H2O variiert werden muss.
Bei weiteren Fragen steht Ihnen gerne unser technischer Support zur Verfügung.
Hotline: 0621-57 20 915
Viel Erfolg bei Ihrer Arbeit!
IHR BIORON TEAM
