PCR Theorie und Protokolle
PDF: 10 things that can kill Your PCR (by Peter Frame)
Einleitung:
Die Idee unendlich viele Kopien von einem DNA-Abschnitt zu machen wurde 1983 von Kary B. Mullis geboren. Die Methode wurde später Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) genannt. Erst Zehn Jahre später erhielt er für diese brilliante Idee den Nobel Preis in Stockholm.
Die Methode der PCR wurde erstmals 1985 publiziert (Saiki et al., 1985). Für die Elongation wurde eine Klenow Polymerase verwendet. Da die Klenow Polymerase hitzeinstabil ist musste vor jedem Zyklus wieder neue Klenow Polymerase zugegeben werden. Die maximale Produktlänge, die damals erreicht wurde betrug 400bp. 1988 erschien der erste Bericht über die PCR mit Verwendung einer themostabilen DNA Polymerase aus Thermophilus aquaticus (Taq-Polymerase) (Saiki et al., 1988). Die PCR-Technik zählt heute zu den wichtigsten Methoden in der Molekularbiologie.
Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB, Erlich HA. (1988) Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 239:487-491.
Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N. (1985) Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analyses for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 230:1350-1354.
Das Prinzip der PCR
1. Denaturierung (Denaturation): Die Reaktionslösung mit den DNA-Molekülen (welche kopiert werden sollen), den Polymerasen (welche die DNA kopieren), den Primern (welche als Start-DNA dienen) und den Nukleotiden (welche an die Primer angehängt werden), wird auf 95°C erhitzt. Dadurch trennen sich die beiden komplementären Stränge, die DNA denaturiert.
2. Hybridisierung (Annealing): Durch das Herabsetzen der Temperatur auf 55°C verbinden sich die Primer mit der DNA - ein Vorgang, den man Hybridisierung (Annealing) nennt. Diese Verbindung ist nur dann stabil, wenn Primer und DNA Abschnitt komplementär sind, sich also zwischen ihren Bausteinen Basenpaare bilden können. An diesen Stellen beginnen die Polymerasen damit, weitere komplementäre Nukleotide anzubauen und damit die Verbindung zwischen Primern und DNA zu stärken.
3. Verlängerung (Elongation/Extension): Die Temperatur wird nun wieder erhöht, diesmal auf 72°C. Das ist die ideale Arbeitstemperatur für die verwendeten Polymerasen, welche weitere Nukleotide an die entstehenden DNA-Stränge anbauen. Zudem brechen die losen Verbindungen zwischen Primern und solchen DNA-Abschnitten wieder auf, die nicht vollständig komplementär (unspezifisch) sind.
Durch die ständige Wiederholung dieser drei Schritte verdoppelt sich jedes Mal die Anzahl an kopierten, identischen DNA-Molekülen. Nach 20 Zyklen enstehen auf diese Weise aus einem einzigen DNA-Doppelstrang etwa eine Million Moleküle.
Die oberen Angaben zu Temperatur und Dauer der einzelnen Schritte beziehen sich auf das am häufigsten verwendete Standardprotokoll. Inzwischen gibt es eine Vielzahl von Abwandlungen, die für spezielle Anforderungen bessere Ergenisse bringen.
